Explorarea mecanismelor moleculare mediate de exozomii plasmatici responsabili de fenotipul migrator al celulelor primare de cancer mamar folosind abordări microfluidice și genomice

Etapa 2020
În cadrul acestei etapei au fost identificate, din baza de date aferentă biobăncii laboratorului, probe de plasmă aparținând pacientelor cu cancer mamar, pentru care deținem date referitoare la capacitatea de migrare a celulelor primare în dispozitive microfluidice. Au fost selectate 66 de paciente cu vârste cuprinse între 30 și 78 de ani, cu tumori mamare caracterizate de capacitate de migrare scăzută (low) sau crescută (high), aparținând tuturor subtipurilor moleculare și stadiilor clinice de la I la IV . Dintre acestea au fost reținute 42 de probe care au avut calitatea și volumul de plasmă necesar pentru izolarea de exozomi.

Etapa 2021
Rezultatele obținute în această etapă au avut la bază următoarele activități: izolarea ARN-ului din exozomii plasmatici izolați de la pacientele cu cancer mamar (A2.1); pregătirea probelor biologice (ARN exozomal) în vederea secvențierii prin tehnologia NGS (ARN-Seq) (A2.2); analiza bioinformatică a datelor NGS (ARN-Seq) (A2.3); fabricarea dispozitivelor de microfluidică (A2.4); evaluarea fenotipului migrator al celulelor tumorale mamare co-cultivate cu exozomii plasmatici, în dispozitivele microfluidice (Partea 1) (A2.5); activități suport de participare la congrese și conferințe în domeniul de cercetare (A2.6).
Au fost evaluate mai multe metode de izolare a exozomilor plasmatici bazate pe precipitare și separare pe coloane de cromatografie lichid-solid și a fost aleasă metoda optimă prin care s-a izolat cantitatea maxima de exozomi plasmatici, plecând de la un volum de 500 ul de plasmă. În același timp, a fost realizat un studiu R&D de identificare a celei mai eficiente metode de extracție a ARN-ului din exozomii plasmatici, prin care să se obțină materialul necesar pentru sinteza de librării NGS. Sinteza librariilor pentru secvențierea speciilor mici de ARN s-a realizat cu kitul Trilink small RNA library, iar secvențierea ampliconilor generați s-a realizat pe platforma Ion Torent (Ion GeneStudio S5 și Ion Chef). Ampliconii filtrați au fost aliniați la genomul de referință uman Human GRCh37/hg19 și la miRBase. Analiza datelor de secvențiere a urmărit filtrarea readurilor, normalizarea, analiza diferențială și selecția miRNA diferit exprimate între grupurile cu fenotip migrator crescut (high) și scăzut (low). Au fost identificate 14 microARN-uri care vor fi luate în considerare pentru analiza funcțională.
Evaluarea modulării fenotipului migrator al celulelor tumorale mamare cu viteză de migrare scăzută (T47D, MCF-7) și crescută (MDA-MB-231), co-cultivate cu vezicule extracelulare izolate din plasma pacientelor ale căror tumori au fost caracterizate de capacitate de migrare crescută respectiv scăzută, s-a realizat în dispozitive de microfluidică, cu canale liniare de 10 µm, funcționalizate cu fibronectină. Urmărirea efectului migrator indus de exozomi s-a realizat prin captarea de imagini succesive la un interval de 10 minute cu ajutorul instrumentului Biostation. Protocoalele legate de tratarea celulelor tumorale cu exozomi au fost optimizate intr-un studiu pilot. Celulele au fost tratate cu exozomii marcați cu PKH26 și evaluate la 24h prin microscopie de fluorescență. Rezultatele au evidențiat internalizarea și distribuția perinucleară a exozomilor, urmând ca în etapa următoare să fie continuat studiul de evaluare a fenotipului migrator al celulelor tumorale mamare, co-cultivate cu exozomii plasmatici, in dispozitivele microfluidice.

În cadrul acestei etape au fost comunicate 3 lucrări științifice in cadrul de-al 32-lea Congres al Societății Române de Radioterapie și Oncologie Medicală – ”Terapii inovatoare în oncologia de precizie” și al celui de-al 7-lea Congres Național al Federației Societăților Române de Cancer, manifestare cu participare internațională, care s-a desfășurat în format on-line în perioada 14-16 OCTOMBRIE 2021:
1. Targeting the invasive phenotype of breast cancer stem-like cells. Valentina Pileczki, Emoke Pall, Simona Visan, Oana Baldasici, Flaviu Drigla, Loredana Balacescu, Ovidiu Balacescu, Oana Tudoran.
2. Potential applications of miRNAs for medical oncology. Ovidiu Balacescu.
3. Correlation of miR-375-3p and miR-210-3p expression with the migratory phenotype in breast cancer. Simona Visan, Ovidiu Balacescu, Loredana Balacescu, Oana Baldasici, Carmen Lisencu,  Andrei Roman, Bogdan Fetica, Oana Tudoran.

Etapa 2022
Rezultatele obținute în această etapă au avut la bază următoarele activități: fabricarea dispozitivelor de microfluidică (A3.1); evaluarea fenotipului migrator al celulelor tumorale mamare co-cultivate cu exozomii plasmatici, în dispozitivele microfluidice (Partea 2) (A3.2); analiza transcriptomică a celulelor tumorale mamare co-cultivate cu exozomii plasmatici (A3.3); analiza funcțională a modificărilor transcripționale induse de exozomii plasmatici (A3.4); diseminarea pe scară largă prin comunicarea și publicarea națională sau internațională a rezultatelor (A3.5).
Co-cultura liniilor celulare T47D și MCF-7 (caracterizate de capacități bazale de migrare scăzute) cu vezicule extracelulare izolate din plasma pacientelor ale căror tumori au fost caracterizate de capacitate de migrare crescută nu a dus la modificarea în nicio direcție a capacității bazale de migrare a celor două linii celulare, în cazul niciunei probe BMG. În schimb, co-cultura liniei celulare MDA-MB-231(capacitate bazală de migrare crescută) cu vezicule extracelulare izolate din plasma pacientelor ale căror tumori au fost caracterizate de capacitate de migrare scăzută sau absentă a dus la inhibarea semnificativă a vitezei de migrare caracteristică acestei linii celulare.
Modificările la nivel transcripțional (mARN) induse de veziculele extracelulare în liniile tumorale mamare au fost evaluate pe lame microarray 8x60k. Exozomii plasmatici asociați potențialului migrator scăzut au indus în linia celulară MDA-MB-231 modificarea de cel puțin 1.5 ori a nivelului de expresie a 1716 gene , în timp ce tratamentul cu exozomi plasmatici asociați cu viteza de migrare crescută au modulat profilul transcripțional a 146 de gene în linia MCF-7, la un prag FR de ±1.5. Rezultatele moleculare sunt în concordanță cu evaluările fenotipice care au evidențiat inhibarea semnificativă a vitezei de migrare prin co-cultura liniei celulare MDA-MB-231 cu exozomi izolați din plasma pacientelor ale căror tumori au fost caracterizate de capacitate de migrare scăzută, în timp ce pentru liniile MCF-7 și T47D nu au fost obținute rezultate statistic semnificative.
Prin interogarea bazei de date miRTarbase (release 9.0) au fost identificate 4299 mARN țintă ale celor 14 microARN-uri de interes obținute prin secvențiere , cu interacțiuni validate și funcționale. Țintele predicționate în miRTarBase au fost intersectate cu pachetele de gene diferit exprimate obținute pe liniile celulare co-cultivate cu exozomi. Analiza funcțională a genelor de interes (țintele identificate și seturile de date complete) a indicat faptul că exozomii plasmatici asociați potențialului migrator scăzut au indus în linia MDA-MB-231 procese legate de sistem imun, semnalizare oncogenică prin MAPK, ciclu celular și activitate ribozomală. Dintre procesele identificate pe linia celulară MDA-MB-231 la nivelul țintelor, cele mai semnificative au fost implicate în transportul prin vezicule extracelulare, ciclu celular și sistem imun.

În cadrul etapei a III-a (2022) au fost publicate 2 articole științifice în revista IJMS, IF=6.208, (Q1)

• Baldasici O, Pileczki V, Cruceriu D, Gavrilas LI, Tudoran O, Balacescu L, Vlase L, Balacescu O. Breast Cancer-Delivered Exosomal miRNA as Liquid Biopsy Biomarkers for Metastasis Prediction: A Focus on Translational Research with Clinical Applicability. Int J Mol Sci. 2022 Aug 19;23(16):9371. doi: 10.3390/ijms23169371. PMID: 36012638; PMCID: PMC9408950. 
• Oana Baldasici, Loredana Balacescu, Daniel Cruceriu, Andrei Roman, Carmen Lisencu, Bogdan Fetica, Simona Visan, Andrei Cismaru, Ancuta Jurj, Lucian Barbu-Tudoran, Valentina Pileczki, Laurian Vlase, Oana Tudoran and Ovidiu Balacescu. Circulating Small EVs miRNAs as Predictors of Pathological Response to Neo-Adjuvant Therapy in Breast Cancer Patients Int. J. Mol. Sci. 2022, 23(20), 12625;  https://doi.org/10.3390/ijms232012625